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栗原 和男; 玉田 太郎; 大原 高志; 黒木 良太
no journal, ,
Hydrogen atoms and hydration water molecules in proteins are indispensable components on many naturally-occurring processes. Neutron crystallography is used to analyze the role of hydrogen in the structure and function of bio-macromolecules. There are two neutron diffractometers for biological macromolecules (BIX-3 and BIX-4) installed at the Japan Atomic Energy Agency (JAEA). They were constructed by Dr. Niimura and his group, and since 2004 the present authors have maintained and developed them. Data collection for a total of 16 proteins and DNA oligomers has been successful using BIX-3 and BIX-4. Data for 10 samples of them have been collected since 2004. From these experiments using BIX-3 and BIX-4, we have summarized an empirical relation between crystal volume, unit cell volume, and diffraction resolution. This provides prior estimate of the quality of neutron measurement on BIX-3 and 4 for given crystal size and cell constants.
大原 高志; 安達 基泰; 玉田 太郎; 黒木 良太; 近藤 英昌*; 西宮 佳志*; 津田 栄*
no journal, ,
不凍タンパク質(AFP)はおもに極地に生息する魚類の体内に含まれるタンパク質で、氷の表面に結合することで氷結晶の成長を抑制し、体液の凝固点を下げる働きを持つ。北海道沿岸に生息するナガガジの体内では多数の3型AFP(nfeAFP)のアイソフォームが発現しており、これらはSP-及びQAE- sephadex結合グループに分類される。どちらのアイソフォームも氷表面に結合する機能は有するが、氷結晶の成長を抑制し、体液の凝固点を下げる機能は両者で大きく異なる。そこで、われわれは両者におけるタンパク質分子周辺の水和水ネットワークを解明し、その違いを明らかにすることでAFPの活性のメカニズムを解明することを目的として、nfeAFPの中性子構造解析に取り組んでいる。本発表では、SP型のnfeAFPであるnfeAFP6の大型結晶作製と単結晶中性子回折実験について報告する。
安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎; 岡崎 伸生; 新井 栄揮; 正山 祥生; 木村 要*; 松村 浩由*; et al.
no journal, ,
本研究では、プロテアーゼとその医薬品候補分子との分子間相互作用を原子レベルで解明することを目的として、阻害剤との複合体の中性子結晶構造解析を実施した。タンパク質の中性子結晶構造解析を行うには、高品質な大型結晶作成のために大量のタンパク質試料が必要となる。本研究では、コドン配列を最適化した人工遺伝子を合成することで効率的な大腸菌発現系を構築し、プロテアーゼの大量調製系を確立した。そして逆相クロマトグラフィーを用いることで自己分解物を完全に除去した純度の高い試料を調製して結晶化を行った。得られた結晶を用いてJRR-3設置しているBIX-4にて中性子回折データを収集した結果、1.9Aの回折データを得ることができた。プログラムPHENIXにより中性子とX線の同時精密化を実施し、世界で初めてHIV-1プロテアーゼの中性子結晶構造解析に成功した。重水素原子の存在と位置を確認するためにオミットマップを作成したところ、顕著な2つのピークを得た。プロトン化された触媒残基(Asp25)及び阻害剤のヒドロキシル基の構造を水素原子を含めて実験で初めて明らかにすることができた。
岡崎 伸生; 大原 高志; 海野 久雄*; 茶竹 俊行*; 栗原 和男; Cachau, R. E.*; Blaber, M.*; 新村 信雄*; 黒木 良太
no journal, ,
タンパク質分子において溶媒和や脱溶媒和、並びに水素結合は安定化に大きく影響し、それらはフォールディングやダイナミクス,分子認識に寄与している。したがって、水素原子の詳細な研究はタンパク質分子構造の認識やそれらから新たな知見を得る手段として重要であるが、水素結合の特性を解析するようなシステムはこれまで存在しなかった。そのようなシステムを構築するために、われわれは水素結合並びに水和水のためのデータベース(生体分子水素水和水データベース: HHDB)を開発した。HHDBは中性子結晶構造解析や超高分解能X線結晶構造解析によって決定された水素原子座標と、それらから導かれる水素結合のデータを保持している。HHDBはWebベースのグラフィカルユーザーインタフェース(GUI)を備え、利用者はWebブラウザを通してHHDBの機能を利用することができる、タンパク分子や溶媒分子などの水素原子座標や水素結合の状況を可視化することができる。Fig. 1は水素結合距離と結合角度をHHDBでプロットした例である。このプロットにおいて水素原子が原点に配置され、各点は水素結合受容体にあたり水素までの結合距離と共有結合との角度を示している。現在われわれは、これらのインタフェースの性能や利便性の向上を目指して改良を続けている。
玉田 太郎; 木下 誉富*; 大原 高志; 栗原 和男; 今井 啓介*; 黒木 良太; 多田 俊治*
no journal, ,
エラスターゼは、立体構造情報を基盤とした創薬手法(Structure-Based Drug Design: SBDD)研究の代表的な題材として用いられてきたセリンプロテアーゼである。しかしながら、X線結晶構造に基づいた多くのSBDD研究の実施にもかかわらず、特異性の高い阻害剤の作製が困難であるのが現状である。よって、エラスターゼの全原子構造情報の取得を目指して、エラスターゼとその阻害剤(FR130180)の中性子結晶構造解析を実施した。試料にはブタ膵臓由来のエラスターゼ(Porcine Pancreatic Elastase: PPE)を用い、FR130180との複合体結晶を作製した。取得した結晶はマクロシーディング法を繰り返すことにより3mm
程度まで成長させた後、JRR3に設置した生体高分子用中性子回折計BIX3で回折実験を行い、1.65
分解能の回折データを収集した。中性子とX線回折データを組合せた精密化により、約2000個の水素及び重水素原子を含むPPEとFR130180の複合体構造を決定した。今回用いた阻害剤FR130180は、エラスターゼの基質を模倣したペプチド様の構造を持っており、PPEとFR130180複合体はセリンプロテアーゼの反応中間体状態を示していると考えられ、セリンプロテアーゼの触媒機構の理解を深めることができた。また、阻害剤とPPE間に、興味深い相互作用の形成も確認され、特異性の高い阻害剤設計に有用な構造情報を取得することができた。